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1待測樣品孔中每孔加入待測樣品100μl,每種樣品設(shè)3個平行孔,;設(shè)兩個陰性對照孔,,每孔加未處理組的細(xì)胞裂解液100μl;另設(shè)一個空白對照孔,,加入純細(xì)胞裂解液100μl,。
2酶標(biāo)板置4℃,,包被過夜,。
3洗板:吸干孔內(nèi)反應(yīng)液,用洗滌液過洗一遍將洗滌液注滿板孔后,,即甩去,,之后將洗滌液注滿板孔,浸泡1-2分鐘,,間歇搖動,。甩去孔內(nèi)液體后在吸水紙上拍干。重復(fù)洗滌3-4次,。
4陰性對照孔每孔加入pbs 50μl,,樣品孔及空白孔每孔加入1:500稀釋的兔抗人aif抗體工作液50μl�,!�
5酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),,孵育60min�,!�
6洗板,,同4,。
7每孔加1:5000稀釋的hrp-標(biāo)記的山羊抗兔抗體工作液 100μl,�,!�
8酶標(biāo)板置37℃培養(yǎng)箱的濕盒內(nèi),孵育60min,�,!�
9洗板,同4,�,!�
10每孔加tmb顯色液 100μl,輕輕混勻10s,,置37℃暗處反應(yīng)15-20min,。
11每孔加100μl 2mol/l h2so4終止反應(yīng),�,!�
12分別測450nm 吸光值w1和630nm吸光值w2,終測得的od值為兩者之差w1-w2,,以減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾,。
13數(shù)據(jù)處理:在得出標(biāo)本s和陰性對照n的 od值后,計算s/n值,。s/n***2.1為陽性判定標(biāo)準(zhǔn),。
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