細胞實驗介紹——慢---建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系

慢---包裝：公司使用3質(zhì)粒慢---包裝系統(tǒng),，細胞系,，慢---系統(tǒng)使用plko.1-egfp、pspax2,、pmd2.g,，過表達慢---系統(tǒng)使用plvx-acgfp,、pspax2,、pmd2.g三質(zhì)粒系統(tǒng),，將質(zhì)粒混勻后使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染至hek293t細胞中,，培養(yǎng)48h后,，收集上清。使用genecopo公司慢---顆粒純化試劑盒將慢---純化,。純化后留取部分檢測---滴度,，其余---凍存于-80℃冰箱中。

滴度檢測：將---顆粒使用梯度稀釋,，分別293t細胞,，72h后，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光表達情況,。根據(jù)細胞熒光量計算---滴度,。

細胞：在---前---對細胞進行計數(shù)，接種約10000個細胞于12孔板中,，培養(yǎng)過夜后使用無培養(yǎng)基稀釋---,，加入12孔板中對細胞進行，---數(shù)量根據(jù)細胞的moi加入若無moi,，需做---梯度：1,，5，10,，50,，感受態(tài)細胞，100 5個梯度對細胞,，6h后去除含---溶液,，加入完全培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)，培養(yǎng)48h后,，重慶細胞,，在熒光顯微鏡下觀察細胞熒光強度。同時加入puromycin對細胞篩選,，篩選約2周時間,。細胞篩選好后，使用定量pcr和western blot檢測目的基因的穩(wěn)定表達情況,。

實驗流程：慢---質(zhì)粒構(gòu)建-hek293t細胞培養(yǎng)-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293t細胞----收集----純化----滴度檢測-細胞-穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞篩選-穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞鑒定

結(jié)果示例：

                                               圖 a ---滴度檢測,；b 目的細胞---效果圖