emsa實(shí)驗(yàn)
emsa:凝膠遷移或電泳遷移率檢測(cè)是一種檢測(cè)蛋白質(zhì)和dna序列相結(jié)合的技術(shù)，初用于研究dna結(jié)合蛋白和其相關(guān)的dna結(jié)合序列相互作用,，可用于定性和定量分析,。分為2種類型：同位素標(biāo)記探針，非同位素標(biāo)記探針,。
通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32p同位素標(biāo)記的dna或rna探針一同保溫，在非變性的聚bing烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針,。dna-復(fù)合物或rna-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同,，可是雙鏈或者是單鏈,。當(dāng)檢測(cè)如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的dna結(jié)合蛋白,，可用純化蛋白，部分純化蛋白,，或核細(xì)胞抽提液,。在檢測(cè)rna結(jié)合蛋白時(shí)，依據(jù)目的rna結(jié)合蛋白的位置,，可用純化或部分純化的蛋白,，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的dna或rn片duan和gua核苷酸片段特異,，和其它非相關(guān)的片段非特異,，來確定dna或rna結(jié)合蛋白的特---。在競(jìng)爭(zhēng)的特異和非特異片段的存在下,，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合,。
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)
操作步驟
1.在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中,。
1qpcr buffer
5 μl
dntp mix( 2mm )
4 μl
引物1(10pm)
μl 2
引物2 ( 10pm)
2μl
taq酶(2u/ul)
1 μl
dna模板( 50ng-1μg/μl )
1 μl
加ddh2o至
μl 50
視pcr儀有無熱蓋,，不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應(yīng)程序,。將上述混合液稍加離心,，立即置pcr儀上執(zhí)行擴(kuò)增。-般:在93°c
預(yù)變性3-5min ,，銅川pcr,，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段: 93°c 40s***58°c 30s***72°c 60s ，循環(huán)30-35
次,，后在72°c保溫7min,。
3.結(jié)束反應(yīng)，---,， pcr產(chǎn)物放置于4°c待電泳檢測(cè)或-20°c長(zhǎng)期保存,。
4. pcr的電泳檢測(cè):如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100ul進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液,，---多少錢,，以
除去石蠟油;否則，直接取5- 10μl電泳檢測(cè),。
二,、使用說明
1、裝載探針
對(duì)于---時(shí)間較短通常為2小時(shí)以內(nèi)的細(xì)胞,，先裝載探針,，后用活性氧陽性對(duì)照及自己感興趣的---細(xì)胞。對(duì)于細(xì)胞---
時(shí)間較長(zhǎng)通常為6小時(shí)以上的細(xì)胞,，先用活性氧陽性對(duì)照及自己感興趣的---細(xì)胞,，后裝載探針,。
原位裝載探針：本方法僅適用于貼壁培養(yǎng)細(xì)胞。按照1：1000用無培養(yǎng)液稀釋dcfh-da,，使終濃度為10微摩爾/升,。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，---怎么做,，加入適當(dāng)體積稀釋好的dcfh-da,。加入的體積以能充分蓋住細(xì)胞為宜，通常對(duì)于六孔板的一個(gè)孔加入稀釋好的dcfh-da的體積為1毫升,。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20分鐘,。用無細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的dcfh-da,。
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